鲤鱼卵钙离子结合活性肽的制备及钙结合机制的研究

【摘要】本论文以鲤鱼鱼卵为研究对象，优化酶解工艺制备鱼卵钙离子结合活性肽（FEP），优化活性肽与钙离子结合条件，制备鱼卵肽钙复合物（FEP-Ca），通过构建缺钙大鼠模型研究FEP-Ca促钙吸收活性。从FEP中分离纯化高活性钙离子结合肽并鉴定其结构，对活性肽与钙结合的机制进行探讨。研究结果如下：1.鲤鱼卵酶解制备FEP条件优化鲤鱼卵脱脂后含有1.09%的磷，氮磷摩尔比为31.31，蛋白质中丝氨酸摩尔百分数为6.81%。以水解度和酶解液钙离子结合活性为指标，优化了鱼卵酶解工艺。结果表明胰蛋白酶对鱼卵的酶解效果最好，当鱼卵脱磷率为30.39%时，在49℃，加酶量3000U/g，底物浓度2%，pH9.0条件下，水解度为31.15%，酶解液结合钙活性最好，500mg/ml酶解液能结合0.67mmol/g的钙。2.FEP-Ca复合物制备条件优化及其稳定性以FEP的单位蛋白钙结合量和钙结合率为评价指标，对肽钙结合反应条件进行优化。结果表明在FEP浓度为5g/L，钙离子浓度为5mM，pH8.0，45℃，1h条件下，FEP单位蛋白钙结合量为0.86mmol/g，钙结合率为86%。此条件下制备的FEP-Ca复合物磷含量为3.78%，氮含量为11.15%，钙含量为7.27%，氮磷摩尔比为6.53。FEP-Ca复合物具有较好的酸碱稳定性，在pH5-8范围内钙保留率高达90%以上。一定的加热处理会导致FEP-Ca复合物钙保留率下降，经过高温杀菌后钙保留率为71.33%。FEP-Ca复合物具有较高的抗消化性，经过胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，钙保留率为89.69%。磷酸盐能与FEP竞争钙离子，随着磷酸盐浓度的上升，FEP-Ca的钙保留率显著下降（p<0.05）。当磷酸盐浓度为30mM时，钙保留率降至37.05%。3.FEP-Ca促钙吸收活性研究缺钙大鼠饲喂FEP-Ca后，可显著增加体重、促进钙吸收、维持血钙和ALP水平稳定，增加骨重、骨密度和骨钙含量，增强骨生物力学性能，使上述指标达到或优于正常对照组水平。FEP-Ca对缺钙大鼠的补钙效果显著优于CaCO3(p<0.05)，而与CPP-Ca无显著性差异。FEP-Ca有望成为新型的补钙制剂。4.FEP中高活性组分的分离纯化及结构鉴定FEP经超滤分离后，将分子量小于5kDa的组分依次经羟基磷灰石层析、分子排阻层析及RP-HPLC分离纯化得到高活性组分，经ESI-QTOF-MS/MS分析，鉴定其氨基酸序列为(pS)S(pS)AF(pS)(pS)ELAR，分子量为1461Da，含有5个丝氨酸，其中有4个被磷酸化修饰，是一种典型的磷酸肽。5.活性肽钙结合机制研究人工合成高活性组分（IPP），经质谱和红外光谱分析表明，生理条件下磷酸基团是钙离子的优先结合部位，1分子IPP能结合4个钙离子，羧酸基团未参与钙离子的结合。红外光谱和圆二色谱分析表明，IPP生理条件下完全以无序状态存在。当同时升高pH（10以上）和钙离子浓度（3mM以上）后，羧基解离，钙离子对磷酸基团电荷产生屏蔽效应，使IPP在疏水作用和氢键作用下形成β折叠结构，并在两个羧酸根之间形成盐桥，进而构建网状结构，形成IPP-Ca纳米颗粒。而当体系中含有混合肽时，则可在pH6-8范围与钙离子结合形成纳米颗粒。IPP在过饱和磷酸钙溶液中与磷酸根竞争与钙的结合，并吸附到Ca-P簌和无定形纳米粒（ACP）表面，抑制晶核形成和ACP定向聚集结晶，还能吸附到结晶表面抑制结晶长大产生沉淀。
【作者】黄海；
【导师】李八方；
【作者基本信息】中国海洋大学，食品科学，2014，博士
【关键词】鲤鱼卵；钙离子结合活性肽；肽钙复合物；钙吸收；结合机制；

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